B）A）D）C）＊＊＊＊69-Rm-irpdezil69-Rm-irp69-Rm-irpevitevitecnadnubAamroN＊P＜0.05egavaeCaeRegavaeCaeRi ll8642022i i ll864204． 第2世代RIBOTACの開発_RNase Lリク224［化合物B］（nM）［化合物A］（nM）［化合物B］（nM）＊＊＊＊A）Cleavage analysis of FLET model RNA and FLET pri-miR-96 RNAB）Abundance of pri-miR-96 under treatment with RIBOTAC of MDA-MB-231C）Relative cleavage of pri-miR-96 by RIBOTAC upon knock down of RNase L by siRNAD）Reduction of 2-mediated cleavage of pri-miR-96 by addition of pri-miR-96 binder図3 RIBOTAC（化合物B）による検証試験EC50nM10siRNA（Control）siRNA（RNase L）2’-5’A4化合物BモデルRNA［化合物B］（nM）pri-miR-960.9nM36nM16nM43nM202001.00.5200.020002005002002005000＊＊P＜0.01＊＊＊＊P＜0.01一方、この条件に対してRNase LをノックダウンするためのsiRNAを併用して実験を行うと、先ほどのpri-miR-96の減少が見られなくなったことから、標的であるpri-miR-96に対してRNase Lを介してその減少作用が得られていることが確認できた（図3-C）。さらに、化合物Bを添加する条件に対してpri-miR-96のリガンドである化合物Aを併用すると、化合物Bによる分解活性が化合物Aの濃度依存的に低下していく結果も得られており、化合物Bが標的のpri-miR-96に結合して作用していることが検証できた（図3-D）。これら一連の実験により、化合物Bが標的RNAに結合し、RNase Lを介して目的のRNAであるpri-miR-96を分解しているというコンセプトの証明ができた5）。 第1世代RIBOTACはリクルーター部位にオリゴ核酸を含むため、合成面およびin vivo実験を行う上で安定性に限界があった。創薬での応用性を考慮すると、これらの問題を解決できる低分子のRNase Lリクルーターの開発が必須であった。そこで筆者②らは、Silvermanらの報告を基にリクルーターの低分子化に取りかかった2）。文献化合物および市販の誘導体計26化合物のRNase Lの切断活性を評価し、より高活性な低分子化合物Cを 見出した（図4A）。続いて、がん関連miRNAであるmiRNA-21を標的として、その前駆体（pre-miR-21）に結合する分子（化合物D）に見出した低分子リクルーターを連結させたRIBOTAC（化合物E）と低活性コントロール分子（化合物E’）を合成し、その機能を検証した。化合物Eに対して、in vitro実験を行ったところ、蛍光回復およびRNase L二量化アッセイ、そしてRNA切断反応と断片のゲル解析、すべてにおいて化合物Eの活性が確認できた。興味深いことに、RNase Lの二量化は数十μMの化合物C添加でようやく有意に効果が確認できたのに対し、RNA切断アッセイでは50nMの化ルーターの低分子化
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