-＋1μM＋＋---（CBB stain）（kDa）------＋＋--＋---＋--＋---------146Figure 1. （a）ミトコンドリアClpPを利用するTPDコンセプト、（b）化合物1, 2の構造Figure 2. （a）in vitroでの化合物1, 2の活性評価、（b）化合物2とdesthiobiotinの競合実験リンカーリンカーTR化合物TR化合物1mM252015（kDa）Ligandfor POIClpPactivatorDegraderMitochondriaTR化合物（1μM）biotin（1μM）1（1μM）desthiobiotin（1μM）2（1μM）ClpPlinkerProtein of interes: POIPOImSAClpPPOI252015（CBB stain）ab12ab--biotindesthiobiotindesthiobiotin2（1μM）ClpPmSAではmSAが顕著に減少した（Figure 2a）。この違いの原因として、mSAとリガンドとの親和性の差が考えられる。BiotinとStreptavidinの親和性はKD＝10－14〜－15Mと非常に強固である一方、desthiobiotinはKD＝10－10〜－11 Mとbiotinには劣る。一般に、タンパク質はリガンドと結合すると安定化する。化合物1においては、biotin部分とmSAとの相互作用により、mSAが安定化し分解されにくくなったと考えられる。実際に、TR化合物とbiotinを併用処理したサンプルでは、TR化合物とdesthiobiotinを併用処理したサンプルより、mSAの分解が妨げられており、この考察を支持する結果となった（Figure 2a）。以降は化合物2を用いて実験を行った。化合物2とdesthiobiotinを競合させることにより、mSA分解が阻害された結果から、仮説どおり化合物2により活性化ClpPとmSAが近接することでmSAが分解されることを確認した（Figure 2b）。なお、細胞ライセートにClpP、mSA、化合物2を混合した夾雑条件でのin vitro分解誘導実験のプロテオミクス解析では、検出された1410種のタンパク質のうち、化合物2の処理で1/2以下に有意に減少したタンパク質はmSAを含めて2.4%（34種）のみであり、化合物2が選択的に作用することを示唆する結果も得ている2）。以上を含めた実2. ミトコンドリアClpPを利用する標的タンパ ClpPはミトコンドリアマトリックス、原核生物、葉緑体に内在するセリンプロテアーゼで、活性化薬との相互作用により非特異的にタンパク質を分解する。そこでClpP活性化薬と標的タンパク質のリガンドを連結した化合物は、標的タンパク質を活性化ClpPに強制的に近づけ、標的タンパク質の選択的な分解を誘導すると考えた（Figure 1a）。ミトコンドリアClpPの活性化薬として既知のTR化合物1）の1つを採用した。また、コンセプト証明のため、Monomeric Streptavidin（mSA）をモデル標的タンパク質として設定し、mSAリガンドのbiotinあるいはdesthiobitonとTR化合物をリンカーを介して連結させた化合物1, 2を設計、合成した（Figure 1b）。3. 化合物1, 2の活性評価 In vitroで化合物1, 2のmSA分解誘導活性を評価した。各化合物とmSA、ClpPをbuffer中でインキュベートしたところ、化合物1を加えたサンプルではmSA量の変化が見られなかった。一方、化合物2を加えたサンプルク質分解誘導薬の創製
元のページ ../index.html#26