MEDCHEMNEWSVol34No1

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H2NT1 = 25 s（H2O, 9.4 T）−13.0−15.7−6.1abcO2）Fast enzymatic reaction:Km = 1.9 mM, Kcat = 255 s−1H2NNMeHNOCOC1）Enough length of T1:57 s（H2O, 3.0 T）APNBinding energy（kcal/mol）Km（ｍM）kcat（s−1）Recognizedby APN3）Large chemical shiftchange: 2.8 ppm4）High water solubility, 5）Biocompatibility,6）Biostability, 7）High polarization efficiency図4　 （a）［1-13C］Ala-NH2の分子設計、 （b）Ala-NH2, Ala-Gly, Ala-Gly-NMe2のAPN結合エネルギーのQM/MM計算値および酵素反応速度定数、（c）Ala-［1-13C］Gly-d2-NMe2の分子設計NH2Me［1-13C］Ala-NH2Ala-NH215.7113MeDDCarboxyl peptidaseDipeptidaseAla-GlyAla-Gly-NMe23.61.932255Me131328aminopeptidase N（APN/CD13）を標的としたDNP-NMR分子プローブを例として、酵素反応性を制御した分子設計について紹介する。APNはペプチドやタンパク質のN末端の疎水性アミノ酸残基（特にAla）を特異的に切断する酵素である。また、この酵素は腫瘍の血管新生や転移に関わるため、腫瘍のバイオマーカーとして知られている18）。筆者らは、2016年にAPN活性を検出可能なDNP-NMR分子プローブとして、［1-13C］Ala-NH2を報告した19）。この分子プローブは、高いAPN選択性と長いT1を志向して設計された。APN活性を検出するための最も単純な構造はAla-Glyのよう なジペプチド構造であるが、ジペプチドはcarboxyl peptidaseやdipeptidaseによって切断される恐れがある。そこで、［1-13C］AlaのC末端をアミド化すること で、分子構造を小さく保ちつつ、C末端側からのオフターゲットによる切断を最小限に抑えた（図4a）。その結果、［1-13C］Ala-NH2は、高いAPN選択性と十分に長いT1（25 s, H2O, 9.4 T）を示し、マウス腎臓破砕液中のAPN活性の検出に成功した。　［1-13C］Ala-NH2は、ex vivoでAPN活性の検出に成功したが、主に1）酵素反応が遅いこと、2）酵素反応前後の化学シフト変化が小さい（1.3ppm）ことから、生体内APN活性の定量的な解析やイメージングには至らなかった。そこで、生体内APN活性イメージングを目指し、酵素反応速度の改善を行った20）。まず、Ala-GlyがAla-NH2よりも高いAPN親和性を示すことに着目し、両基質のAPN認識機構を解析した。QM/MM計算により、APN活性ポケット内におけるAla-NH2とAla-Glyの結合エネルギーを計算したところ、Ala-GlyのGly部位とAPNのE384の相互作用が、Ala-NH2では見られない結合エネルギーの安定化に寄与することが明らかとなった（図4b）。この計算結果に基づき、ジペプチドを基本骨格とした分子プローブの探索を行った結果、Ala-Gly-NMe2がAla-NH2より速い酵素反応を示す構造として見出された。Ala-Gly-NMe2の酵素反応速 度定数は、Km=1.9mM, kcat=255 s－1であり（図4b）、Ala-NH2の値（Km=15.7mM, kcat=113 s－1）と比較して、特にKmは一桁小さい値を示した。また、Ala-Gly-NMe2についても、APN活性ポケット内における結合エネルギーを計算すると、Ala-Glyと同様に、Gly部位が結合エネルギーの安定化に寄与していることがわかった（図4b）。以上をまとめると、Ala-Gly-NMe2の速い酵素反応は、主にAPN親和性の大幅な向上によって達成された。　Ala-Gly-NMe2にさらなる分子修飾を施すことで開発したAla-［1-13C］Gly-d2-NMe2は、十分に長いT1（57 s, H2O, 3.0 T）、および酵素反応に伴う大きな化学シフト変化（2.8ppm）を示した。この分子プローブは、各部分構造がそれぞれ役割を果たすことで、上述（第3項）の1）～7）の制約を満たしている（図4c）。超偏極したAla-［1-13C］Gly-d2-NMe2をMIA PaCa-2担がんマウスに尾静脈投与したところ、腫瘍部位においてAPN活性を選択的に検出することができた。さらに、位置ごとの化学シフト情報を得るchemical shift imagingによって腫瘍部位を撮像した結果、腫瘍内において生成物シグナルの増大が見られた。よってこの分子プローブが、部位特異的なAPN活性の検出に基づく腫瘍診断に応用できる可能性が示唆された。このように、酵素認識機構の解析に基づく緻密な分子設計により、実用的なDNP-NMR分子プローブの開発に成功した。