71Figure 1 UPSを利用したPROTACの標的タンパク質分解もっていないことから、最適なリガンドが存在しないものがほとんどであり、低分子のみで転写因子に対するPROTACをデザインすることは困難である。 現在、ヒトでは約1,600種類の転写因子が報告されており、そのうちおよそ96%のDNA結合領域の配列が明らかにされ、データベース化されている3）。そこで筆者らは、転写因子に結合するDNA配列をベースとしたデコイ核酸を標的リガンドとして利用することで、転写因子を標的とした汎用性のある新規PROTACを開発できるのではないかと考えた。本稿では、エストロゲン受容体α（Estrogen Receptor α：ERα）を転写因子のモデルとした、デコイ核酸型PROTACの開発について紹介する4）。2. デコイ核酸型PROTACの設計 ERαのリガンドには、ERαタンパク質とエストロゲン応答配列（ERαが結合するDNA配列）の共結晶X線構造を基に5）、21塩基のデコイ核酸を設計し、アルキン修飾したDNA（ER（dec））を合成した。また、E3リ ガーゼリガンドには、汎用されている3種類のリガンド（LCL161、VH032、Pomalidomide）を選択し、それぞれに末端をアジド化したPEG3リンカーを導入した分子を設計した。これらを、銅触媒を用いたクリック反応 で連結し、目的とするPROTACを3種類（LCL-ER （dec）、VH-ER（dec）、POM-ER（dec））設計・合成した（Figure 2）。3. デコイ核酸型PROTACの活性評価 合成したPROTACのERα結合活性を競合的な蛍光偏光法を用いて評価した。ER（dec）の末端にFAM（Fluorescein）で蛍光標識化したFAM-ER（dec）を プローブとし、各PROTACを競合させ、半数阻害濃 度（IC50）を算出することで結合活性を評価した。その結果、ER（dec）は、IC50＝39.4nMでERαに結合し、LCL-ER（dec）IC50＝31.2nM、VH-ER（dec）IC50＝43.7nM、POM-ER（dec）IC50＝52.6nMと、いずれもER（dec）と同等のERα結合活性を示したことから、デコイ核酸のPROTAC化（E3リガーゼリガンドとの連結）は、ERα結合活性に対し顕著な影響を与えないことが示唆された。 各PROTACのERα分解活性は、乳がん細胞株MCF-7細胞を用いたウェスタンブロッティングで評価した。PROTACをLipofectamine RNAiMAXにより細胞にトランスフェクション後、24時間培養し、ERαタンパク質の発現量を定量解析した。その結果、3種類のPROTACはいずれもERα分解活性を示し、中でも
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